پاسخ سوالات دستگاهی

سلام

به شدت اعتقاد دارم آزمون ها (مانند امتحان پایان ترم شیمی تجزیه دستگاهی ) آخرین حلقه فرایند یادگیری است. به تجربه ثابت شده است که آنچه را در سرجلسه امتحان یاد می‏گیریم خیلی دیرتر و حتی هیچگاه فراموش نمی‏کنیم زیرا که عمق بیشتری از لحاظ یادگیری در ذهن مان ایجاد کرده و حتی یادآوری آن نیز به سهولت انجام می‏شود.

دانشجویان با انگیزه هیچگاه از ندانستن نمی‏هراسند ایشان از ندانستن خود پلی می ‏سازند تا با انگیزه بیشتری در آینده مطالب را بخوانند، تحلیل کنند و به کار ببرند و در نهایت سعی کنند آن‏را هضم نموده و بفهمند. اینگونه دانشجویان را به راحتی می‏شود از برگه ‏های پاسخنامه امتحانی ‏شان شناسایی کرد همان ‏هایی که تا آخرین لحظه درگیر حل یک مطلب مفهومی در بین سوالات امتحانی هستند و هیچ‏گاه خودشان را نا امید از حل نمی ‏بینند و بلافاصله بعد از اتمام زمان امتحان در پی پاسخ درست آن می ‏دوند و سعی می‏کنند موانع بین ذهن‏شان و پاسخ صحیح را به سرعت بیابند و در جهت رفع ان‏ها برای سوالات مشابه در امتحانات آینده برنامه ‏ریزی کنند. و در مقابل این عده هستند افراد زیادی که تنها دلیل استرسشان در امتحان ترسی از افتادن واحد درسی بدلیل "عدم مطالعه صحیح در زمان مناسب" است.

چون در بین افراد کلاسم در درس تجزیه دستگاهی تعدادی کمتر از انگشتان یک دست وجود داشتند که تشنه یافتن پاسخ‏های صحیح سوالات امتحان امروز هستند. به قصد کمک به ایشان و تشویق آن دسته از دوستانی که هنوز طعم یافتن پاسخ های صحیح را نچشیده اند! بر آن شدم که پاسخ سوالات دستگاهی را در این پست قرار دهم.!

بفرمایید پاسخ ها را:

التماسانه 93

سلام

امتحان شیمی عمومی 2 به پایان رسید. حالا من مانده ام این التماسانه های جدید! خودتان ملاحظه بفرمایید. راستی اگر جای من بودید چه پاسخی به این مطالب نازیبا می دادید؟

دشمنتان شرمنده!

اما کاش آنجور وقت می گذاشتید که الان شرمنده نمی شدید ای کاش ای کاش...

ان شاءالله حداقل در کارتون موفق بشید!

پیشاپیش از شما درخواست می کنم منتظر عنایت نباشید چونکه زیراکه بدلیل آنکه !!! کوتاهی شما را من نمی توانم جبران کنم.!

نمیشد لطف شما در درس خواندن بیشتر و بیشتر و خوندن در طول ترم شامل حال من میشد واقعا نمیشد شامل حال تمامی اساتید و از جمله من هم میشد !!

فکر می کنم بخاطر طوفان 120 کیلومتر بر ساعت تهران بوده که خونده های شما رو با خودش برده!

علیکم السلام و الرحمه الله (به این میگن یه التماسانه مودبانه اول سلام میکنند!)

شاید هم کمی مسئولین مقصر بودند که اینطور برنامه امتحانی برای شما تنظیم کرده اند. خوب بود از قبل میدونستید که برنامه امتحانتون فشرده است و به فکر می بودید. 

و علیکم السلام (به به دانشجویان چقدر با ادب شده اند. الهی شکر!)

البته استاد کسی را نمی اندازد مقصر این پله های دانشکده است که تا کنون باعث شده چندین نفر از دانشجویان بیافتند که سند زنده آن نیز موجود است. نمونه اش همین امروز اتفاق افتاد یکی از دانشجویان که داشت داستان عریض و طویل نخواندنش و مشکلات داشته و نداشته اش در همین چند روز مانده به امتحان، را برای من تعریف می کرد و از پشت سر من مشغول پیمودن پله های مبارک بود، به ناگهان لیز خورد و سر خورد و داشت میرفت سر مبارک و (البته سنگین ایشان) تماس شدید پیدا کند با راه پله های سخت، که همین جانب به دادش رسیدم و در حرکتی بسیار سریع!!! دست او را گرفته و بلندش کردم ملاحظه فرمودید که ما نه تنها نمی اندازیم بلکه نمی گذاریم که بیافتند یا حتی افتاده ها را بلند می نماییم. ! اگر این مطلب را قصه فرض می نمایید سندش هم موجود است حی و حاضر!

با اکرامات بی نهایت!

نمیشه نمره گرفتنی است!

سلام دانشجوی محترم ... (راستی این سه تا نقطه کلی حرف در دل خودش داره معلومه که دلتان حسابی پره!)

میدونی چن تا خدا بکار بردی؟ یعنی میشه تنبلی خودمون و عدم برنامه ریزی هامونو با قسم دادن به خدا و امام زمان برطرف کنیم؟ یعنی میشه!!!!

خوب شد یاداوری کردی جشن میلاد امام زمان (عجل الله الفرجه الشریف) نزدیکه، ان شاءالله با دعا کردن در شب نیمه شعبان و توسل به آن حضرت هم حاجات خودتون را از خداوند بگیرید و هم برای من دعا کنید و برای پدر یکی از بچه های دانشکده که در بستر بیماری است.

سلام بر شما دانشجوی سخت کوش بازی گوش!

دست به آب بندی مغزتان نزنید مشکل اینجاست که درس شیرین تر از عسل! شیمی را نمیتوان با یک شب دو شب یادگرفت و به راحتی به خاطر آورد. آنچه شما میگویید فراموشی چیزی نیست جز سردرگمی ذهنتان از هجمه زیاد مطالب وارد شده به آن  در یک زمان اندک

یا علی

موفق باشید

سلام

این پست به نمونه سوالات شیمی تجزیه دستگاهی ترم دوم سال تحصیلی 92-93 اختصاص دارد 

دانشجویان محترم می توانند در قسمت نظرات این پست سوالات و اشکالات خود را مطرح نمایند تا همراه با پاسخ آن در ذیل قرار دهم.

با تشکر

 درباره ی PMT

PMT از خانواده ی تیوب های خلا هستند و می توانند نور مرئی ماورا بنفش و فرکانس های نزدیک مادون قرمز را آشکار سازی کنند. این آشکار سازها می توانند نور تابشی را تا صد برابر تقویت کنند. در واقع در مسیر فوتون فرودی چندین کاتد قرار می دهند و می توانند این فوتون را حتی در حالتی که شار فرودی خیلی کم است آشکار کنند. 

یک تکثیرکنندهٔ نوری از یک شیشهٔ لامپ خلاء ساخته شده‌است که درون آن یک فوتوکاتد و چندین کاتد ثانویه و یک آند قرار دارد. فوتونتابشی به مادهٔ فوتوکاتد که به صورت لایهٔ نازکی در پنجرهٔ وسیله ته‌نشین شده‌است برخورد می‌کند و در نتیجهٔ تأثیرات فوتوالکتریکالکترون‌ها تولید می‌شوند. این الکترون‌ها به‌وسیلهٔ فوکوس کردن کاتدها به سمت تکثیرکنندهٔ الکترون (جایی که الکترون‌ها به‌وسیلهٔ فرآیند تابش ثانویه تکثیر می‌شوند) جهت دهی می‌شوند.

فوتون (در اینجا قرمز رنگ) به سطح خاکستری رنگ فوتو کاتد برخورد می‌کند.

تکثیرکنندهٔ الکترون از تعدادی الکترود تشکیل شده‌است که کاتد ثانویه نامیده می‌شوند. تمامی این کاتدهای ثانویه در ولتاژی مثبت تر از کاتد ثانویهٔ قبلی خود قرار داده می‌شوند. الکترونی که فوتوکاتد را ترک می‌کند مقداری انرژی از فوتون‌های وارده دارد. وقتی که وارد اولین کاتد ثانویه می‌شود به‌وسیلهٔمیدان الکتریکی شتاب می‌گیرد و به انرژی بالاتر می‌رسد. در جرقه گیری اولین کاتد ثانویه بیشتر الکترون‌های انرژی پایین به سمت دومین کاتدثانویه شتاب می‌گیرند و فرستاده می‌شوند. کاتد ثانویه‌ها به صورت سری به یکدیگر متصل شده‌اند و در هر صورت در هر مرحله تعداد الکترون‌های تولید شده افزایش می‌یابد و در آخر به آند می‌رسند جایی که انباشتگی بارها یک جریان تند را نتیجه می‌دهد.

لامپ‌های تکثیرکنندهٔ نور برای کارکرد درست به ۱۰۰۰ تا ۲۰۰۰ ولت احتیاج دارند. بیشترین ولتاژ منفی به کاتد متصل می‌شود و بیشترین ولتاژ مثبت به آند. ولتاژها به‌وسیلهٔ یک درایور ولتاژ مقاومتی بین کاتدهای ثانویه توزیع می‌شود که این تغییرات به‌وسیلهٔترانزیستور‌ها یا دیودها تحقق می‌یابند. وقتی تکثیرکننده‌های نوری روشن می‌شوند باید نسبت به نور محیط محافظت شوند تا با ازدیاد انتشار امواج آسیب نبینند. ا

   انواع آکسوکروم

پاسخ:

گروههای عاملی که خود در اسپکتروفتومتری فاقد جذب هستند (یعنی کرموفور نیستند) اما وجود آنها در ترکیب باعث تغییر در شدت جذب یا تغییر در طول موج می شود را آکسوکروم میگویند و بر اساس نوع تغییر ایجاد کننده تقسیم بندی می شوند

1-   آکسوکروم هایی که باعث جابجایی قرمز می شوند.

2-   آکسوکرومهایی که باعث جابجایی آبی میشوند

3-   آکسوکرومهایی که باعث افزایش ضریب جذب مولی میشوند

4-   آکسوکروم هایی که باعث کاهش ضریب جذب مولی گونه می شوند

- هدف از تصحیح زیمان چیست؟

پاسخ داخل جزوه

- تفاوت دستگاهوری UV-VIS و IR چیست؟

پاسخ داخل جزوه

- مزایای FT-IR نسبت به IR معمولی چیست؟

در جزوه موجود است.

- استفاده از منابع با شدت زیاد در جذب اتمی چه تاثیری بر جذب دارد؟ چرا؟

پاسخ :

تاثیری ندارد.!!!!!!!!!!!!!

زیرا فرایند جذب از قانون بیر تبعیت میکند و افزایش شدت پرتو ورودی باعث افزایش شدت پرتو خروجی نیز می شود از آنجا که در جذب نسبت بین پرتو خروجی به ورودی سنجیده می شود افزایش شدت تابش ورودی تاثیری بر جذب ندارد.

 در مورد شکل دستگاه ها

منظور از دستگاهوری مشخص کردن جایگاه قرار گرفتن منبع، طول موج گزین، سل نمونه یا مرجع یا وسیله جایگزین آن، آشکارساز و در اخر پردازش کننده است.

دستگاهوری عمومی تکنیک ها به صورت زیر است

پردازشگر<------آشکارساز<----------- طول موج گزین<---------------- سل نمونه<--------------- منبع نوری

البته در برخی موارد جای طول موج گزین و سل نمونه به علت شدت پرتو های منبع تابش عوض می شود مثلا در اسپکتروفتومتری مریی فرابنفش برای جلوگیری از تجزیه گونه یا گونه ها این کار انجام می شود و در برخی از تکنیک ها مانند فلوئورسانس و فسفرسانس یک مونوکروماتور (طول موج گزین) بین منبع تابش و سل نمونه قرار می گیرد 

زاویه بین منبع تابش و دتکتور (آشکارساز) نیز حائز اهمیت است مثلا در فلوئورسانس این دو با هم زاویه 90 درجه می سازند در حالی که در جذب اتمی زاویه صفر درجه

در روش نشر اتمی نیازی به منبع تابش نیست یعنی سل نمونه که شعله یا پلاسما است هم اتم ساز هم منبع تابش است

- منظور از دستگاهوری یک تکنیک چیست؟

دستگاهوری یعنی ترتیب قرار گرفتن اجزاء مختلف یک دستگاه

- دستگاهوری تکنیک های IR, UV-VIS, AAS, AES,AFS,Ramman,fluorescence phosphorescence spectroscopy

را رسم جذبی یا نشری بودن آنها و نیز نوع تکنیک (مولکولی و اتمی) را برای هر یک  مشخص کنید

دستگاهوری اسپکترومتری فلوئورسانس

یا

دستگاهوری ICP-AES

دستگاهوری AAS

یا

هر یک از اتفاقات روی شکل را توضیح دهید

پاسخ:

دستگاهوری IR

-انواع تیتراسیونهای فتومتری را بنویسید؟

Analyte + Reagent = Product

	Analyte	Reagent	Product
a	Colorless	Colorless	Colored
b	Colorless	Colored	Colorless
c	Colored	Colorless	Colorless
d	Colored	Colored	Colorles

تفاوت فسفرسانس و فلوئورسانس را بنویسید

پاسخ:

1-حساسیت فسفرسانس از فلوئورسانس بیشتر است

2-فسفرسانس در ترکیبات کمتری نسبت به فلوئورسانس وجود دارد

3-گزینش پذیری فسفرسانس از فلوئورسانس بیشتر است

4-فسفرسانس در طول موج های بالاتری از فلوئورسانس رخ می دهد

5-تابش فسفرسانس بعد از قطع منبع تابش تحریک کننده برای مدتی ادامه می یابد حال آنکه تابش فلوئورسانس بلافاصله بعد از قطع تابش متوقف می شود

6-فسفرسانس حاصل آسایش نشری از تراز نیمه پایدار و غیر مجاز T ولی فلوئورسانس حاصل آسایش نشری از تراز پایدار S بالاتر به یکی از ترازهای ارتعاشی پایه می باشد.

-علت بی رنگ بودن برخی ترکیبات شفاف در نور معمولی چیست؟

پاسخ:

بی رنگ بودن دو حالت دارد یا کروموفور جذبی در ترکیب وجود ندارد و یا کروموفور جذبی آن طول موج های مریی را جذب نمی کند

- کاربرد عمده استفاده از تکنیک IR را بنویسید.

پاسخ:

از دستگاه  IR  بیشتر جهت شناسایی گروههای مختلف موجود در مواد استفاده می شود . ناحیه خاصی از  IR  که به نام ناحیه اثر انگشت یا  Fingerprint  نامیده می شود (ناحیه 600 – 1400  cm-1)وجود دارد که طیف  IR  هر جسم مختص همان جسم بوده و برای اثبات یکسان بودن دو جسم از این ناحیه استفاده می شود .از روی طیف  IR  یک جسم مجهول میتوان گروههای مختلف موجود در آن را به دست آورد.

کاربرد کمی IR بسیار محدود بوده و مبتنی بر قانون بیر-لامبرت می باشد

-  آماده سازی نمونه را برای تکنیک IR به چه صورت انجام می شود؟

پاسخ:

در این تکنیک می توان از نمونه های جامد به طور مستقیم استفاده کرد.

نمونه جامد: معمولا حدود 5 تا 15 میلیگرم نمونه را با حدود 400 میلی گرم برمور پتاسیم خالص و خشک مخلوط کرده ، بصورت پودر نرم و یکنواخت در آورده و با فشار زیاد بصورت یک قرص نازک و شفاف در می آوریم .  K Br در طول موج 2.5 تا 25 میکرون جذب ندارد و امکان میدهد که از نمونه طیف کاملی به دست آوریم.

میتوان از نمونه جامد به صورت سوسپانسیون ذرات بسیار ریز طیف گرفت . در این صورت حدود 5 میلیگرم جسم را با یک قطره از  Nujol  ( یک هیدرو کربور اشباع شده پارافینی با وزن مولکولی بالا ) به صورت سوسپانسیون  یکنواخت تهیه می کنیم .

نوژول در نواحی 3030 – 2860   cm-1( بخاطر ارتعاشات کششی پیوند C-H  ) و همچنین در نواحی 1460 و 1374   cm-1(ارتعاشات خمشی پیوند  C-H  ) جذب دارد .

وجود جذب در نوژول باعث می شود که اگر جسم در این نواحی جذب داشت ،تداخل ایجاد شود ، که در این صورت میتوان از هگزا کلرو بوتا دی ان استفاده کرد که فاقد پیوند  C-H  می باشد و در نتیجه میتوان جذب مربوط به  C-H  نمونه را مشاهده کرد.

نمونه مایع : میتوان2 قطره از مایع را بین دو سل کلرور سدیم قرار داد .

اگر نمونه محلول حاوی حلال باشد ، چون همه حلالها در نواحی مختلف IR  کم وبیش جذب دارند ، باید از حلال تنها به عنوان شاهد استفاده کرد .اگر نمونه با ویسکوزیته کم یا فرار باشد، از سلهای با ضخامت  mm0.1 استفاده می شود .

اگر نمونه به صورت گاز باشد از سلهایی که 10 سانتی متر طول دارد ،استفاده کرده و نمونه را به   فضای آن تزریق می کنیم .

- نقش پلاسما در تکنیک ICP-AES چیست؟

پاسخ:

نقش اول: اتم ساز (ایجاد گرمای بالا برای تبدیل اتم از گونه ها)

نقش دوم: تامین انرژی برانگیخته گی برای اتم ها 

نمایش همزمان پتانسیل زمان و جریان پتانسیل در روشهای مختلف ولتامتری

LSV

Cyclic Voltammetry

تصویری از ستونهای HPLC

برای دیدن ستونهای متداول HPLC تشریف ببرید با ادامه مطلب

مدیریت زمانی امتحان

ساعت	جلسه امتحان	پروسه پیشنهادی	تاریخ	ایام هفته
			10/03/93	شنبه
			11/03/93	یکشنبه
			12/03/93	دوشنبه
			13/03/93	سه شنبه
		تعطیل	14/03/93	چهارشنبه
		تعطیل	15/03/93	پنج شنبه
		تعطیل	16/03/93	جمعه
			17/03/93	شنبه
			18/03/93	یکشنبه
از ساعت 20 تا 22		پاسخ به سوالات احتمالی شیمی عمومی 2 از طریق وبلاگ	19/03/93	دوشنبه
	سوم	شیمی عمومی 2	20/03/93	سه شنبه
از ساعت 20 تا 22		پاسخ به سوالات احتمالی شیمی تجزیه دستگاهی از طریق وبلاگ
	سوم	شیمی تجزیه دستگاهی	21/03/93	چهارشنبه
			22/03/93	پنج شنبه
		تعطیل	23/03/93	جمعه
		تعطیل	24/03/93	شنبه
از ساعت 20 تا 22		پاسخ به سوالات احتمالی شیمی تجزیه 1 از طریق وبلاگ	25/03/93	یکشنبه
	دوم	تجزیه 1	26/03/93	دوشنبه
			27/03/93	سه شنبه
			28/03/93	چهارشنبه
			29/03/93	پنج شنبه
		تعطیل	30/03/93	جمعه
			31/03/93	شنبه
از ساعت 20 تا 22		پاسخ به سوالات احتمالی اصول تصفیه آب و پسابهای صنعتی از طریق وبلاگ	01/04/93	یکشنبه
از ساعت 18 تا 20		پاسخ به سوالات احتمالی شیمی تجزیه 2از طریق وبلاگ
	اول	اصول تصفیه آب و پسابهای صنعتی	02/04/93	دوشنبه
	دوم	تجزیه 2
			03/04/93	سه شنبه
			04/04/93	چهارشنبه
			05/04/93	پنج شنبه
		تعطیل	06/04/93	جمعه
			07/04/93	شنبه
			08/04/93	یکشنبه
			09/04/93	دوشنبه
			10/04/93	سه شنبه
			11/04/93	چهارشنبه
				پنج شنبه
				جمعه

دانلود کنید.

در این روزهای پایانی ماه رجب و روزهای ابتدایی ماه شعبان ما را از دعای خیر خود بی نصیب نگذارید.

برخی لینکهای مهم از سایت http://www.hm124.ir/2/index.php

حل مسایل انتخابی اسکوک وست

گرم

انواع ستون ها و کاربرد آنها در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا :

1- کروماتوگرافی فاز معکوس , Reversed Phase 

انواع دارو ها , ویتامین های محلول در چربی ( K , E , D , A ) , ویتامین های محلول در آب ( B12 , B6 , B5 , B3 , B2 , B1) , آنتی بیوتیک ها , ضد صرع , اسید آمینه , اسید چرب , پپتید , پروتئین , آنزیم , DNA , RNA , نوکلئوتید , افزودنی های غذایی , افزودنی های پلیمر و ...

2- کروماتوگرافی فاز نرمال , Normal Phase

قندها , اولیگو ساکاریدها , دارو ها , داروهای قطبی , گلیکان ها , ویتامین های محلول در آب , داروهای شیمی درمانی و ...

3- کرماتوگرافی طرد غربالی , Size Exclusion

پروتئین و پلیمرهای محلول درآب – پلیمرهای محلول درمواد آلی , کربوهیدرات ها , پلی ساکاریدها , اولیگو ساکاریدها , اسیدنوکلئیک , DNA , RNA , اولیگو نوکلئوتید , پپتید , ویروس ها , پلیمرهای صناعی , اولیگومرها و ...

4- کروماتوگرافی تعویض یونی , Ion Exchange

آمینو اسیدها , پپتید , پروتئین , پورین , پیریمیدین , نوکلئوزید , نوکلئوتید , اولیگو نوکلئوتید , DNA , RNA , محصولات PCR و مونوساکارید , دی ساکارید و ...

5- کروماتوگرافی آب گریز , Hydrophobic Interaction

RNA ریبوزومی , پروتئین , اجزای آنتی بادی , آنتی بیوتیک , آنزیم ها و ...

6- کروماتوگرافی تمایلی , Affinity

کربوهیدرات ها , کاتکول آمین , بیو مولکول ها , پپتید , پروتئین , پروتئین های هیستیدین دار , ایمونو گلوبولین , پروتئین های شیر , پروتئین های غشایی , تراتسفرین , ریبونوکلئاز , آنتی ژن ها , آنتی بادی ها , آنزیم ها و ...

مروری بر روش کرماتوگرافی مایع با کارایی بالا

مروری بر روش کرماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) از جمله تکنیک های جداسازی (Separation) مرسوم در بسیاری از علوم است. در این مقاله ابتدا به تاریخچه ای از کروماتوگرافی، اصطلاحات و روابط آن اشاره می شود و در ادامه به نحوه انتخاب دقیق پارامترهای دستگاهی وآزمایشگاهی به منظور انجام یک جداسازی کارآمد اشاره می شود. پارامترهایی از قبیل انتخاب نوع ستون و انتخاب فاز متحرک که به قطبیت آنالیت بستگی دارد و یا انتخاب آشکارساز مناسب که به ساختار و ویژگی های شیمیایی نمونه بستگی دارد. و در نهایت به نحوه آنالیز کمی و کیفی کروماتوگرام اشاره می شود.

1 مقدمه - تاریخچه کروماتوگرافی:
بدون شک مهمترین و پرکاربردترین روش جداسازی، روش "کروماتوگرافی" است. کروماتوگرافی (Chromatography)، بوسیله یک گیاه شناس روسی به نام تسوت، در اوایل قرن بیستم (1903) کشف شد. او از این تکنیک برای جداسازی رنگدانه های مختلف گیاهی مانند کلروفیل‌ها و گزانتوفیل‌ها استفاده کرد. 
روشهای کروماتوگرافی بر پایه دو مفهوم کلی دسته بندی می شوند: در روش اول، جداسازی بر اساس مفاهیم فیزیکی صورت گرفته و شامل دو گروه کروماتوگرافی ستونی (Column) و کروماتوگرافی سطحی است.
اساس نام گذاری در دسته بندی دوم که مرسوم‌ تر است، نوع فاز متحرک، فاز ساکن و همچنین نوع تعادل ایجاد شده بین دو فاز است. این دسته شامل دو گروه کلی کروماتوگرافی مایع (فاز متحرک مایع می باشد) و کروماتوگرافی گازی (فاز متحرک گاز) است.

2 مفاهیم کلیدی در کروماتوگرافی

درتمامی روشهای کروماتوگرافی، جداسازی بر پایه تفاوت مقداری آنالیت (ماده مورد جداسازی) در دو فاز ساکن (Stationary Phase) و متحرک (Mobile Phase) انجام می شود . این تفاوت مقدار، در نهایت منجر به تشکیل تعادلی می گردد که آن را با پارامتری به نام ثابت توزیع (K) بیان می کنند. در این رابطه Cm و Cs به ترتیب نشان دهنده غلظت مولی آنالیت در فازمتحرک و فاز ساکن است.

نتایج تحقیقات نشان می دهند که پدیده های فیزیکی و شیمیایی متفاوتی بر روی سرعت جداسازی و همچنین پهنای باند دیده شده برای هر آنالیت تاثیر دارند. از بین تئوری های موجود که به توجیه و محاسبه این عوامل می پردازند، تئوری بشقابک های فرضی (Plates) کاربرد بیشتری دارد. در این تئوری فرض می شود که هرستون از یک سری لایه های باریک، افقی وکاملا مجزا از هم، که به طور متوالی قرار گرفته اند، تشکیل شده است. به هر یک از این لایه ها، بشقابک گفته می شود. در هرکدام از این بشقابکها آنالیت در تعادلی بین فاز متحرک و ساکن قرار دارد و در نهایت با انتقال بین بشقابک‌ها عمل جداسازی صورت می پذیرد. کارایی هر ستون به تعداد بشقابک‌های موجود درستون و یا به عبارت دیگر به تعداد تعادل های ایجاد شده در ستون بستگی دارد. بنابراین برای بررسی کارایی ستون تعداد بشقابک های فرض (N)را از رابطه زیرمحاسبه می کنند. در این رابطه H نشان دهنده ی ارتفاع هر بشقابک و L طول ستون را به نمایش می گذارد.

در این مباحث پارامترها و تعاریف مختلف دیگری به منظور محاسبه کارایی ، شرایط آزمایشگاهی و در نهایت اندازه گیری کمی آنالیت وجود دارند. برای اطلاعات بیشتر به منبع شماره 1 مراجعه شود.] [

3 کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا 

از میان تکنیک های جداسازی، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (High Performance Liquid Chromatography -HPLC)، بیشترین رشد و کارایی را داشته است و سالیانه میلیونها دلار صرف خرید و فروش دستگاههای HPLC در دنیا می شود. علت این رشد را می توان به حساسیت بالا، تعیین مقدار کمی با صحت بالا، قابلیت آنالیز نمونه های غیرفرار و حساس به دما که با تکنیکGC (کروماتوگرافی گازی) امکانپذیر نیستند، نسبت داد.

3-1 فاز ساکن و فاز متحرک 

در مورد قطبیت فاز‌های ساکن و متحرک یک قاعده کلی وجود دارد. طبق این قاعده، قطبیت حل‌ شونده و فاز متحرک باید نزدیک به هم باشد، ولی با فاز ساکن اختلاف داشته باشد. ترتیب قطبیت گروه‌های عاملی در ترکیبات به صورت زیر است:

هیدروکربن < اترها < استرها < کتون‌ها < آلدئیدها < آمیدها < آمین‌ها < الکل‌ها

خصوصیات فاز متحرک در HPLC در زیر آمده است:
• درصد خلوص بالا ( حلالهایی با درصد خلوص بسیار بالا ، HPLC Grade، در بازار موجود است که قیمت بالایی نیز دارد.)
• نقطه جوش بالاتر از دمای ستون ( به خصوص در مواردی که با گرمکن (Oven) کار می شود)
• واکنش پذیری کم (Inertness)
• قابلیت تطابق با آشکارساز 

3-2 اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه HPLC
دستگاه و تجهیزات HPLC شامل قسمت های مختلفی است که در ادامه به آنها اشاره می شود:

1- مخازن حلال: که در آنها فاز متحرک و یا حلالهای شستشو دهنده ستون ریخته شده است.

2- موتور یا پمپ: به منظور انتقال حلال و همچنین نمونه در فضای نسبتا طویل ستون نیاز به ایجاد فشاری در سیستم است که برای ایجاد آن حداقل از یک پمپ یا موتور استفاده می شود. حلال (فاز متحرک) توسط پمپ با سرعت و جریان ثابتی بر روی فاز ساکن حرکت داده می شود. فشار سیستم به اندازه (سایز) ذرات موجود در ستون، گرانروی (Viscosity) و سرعت جریان فاز متحرک بستگی دارد. بسته به نوع جداسازی، میزان سرعت جریان فاز متحرک تعیین می گردد. در مواردی که با تعددی از آنالیت‌ها مواجه هستیم، هر گونه جدا شده خود را به صورت یک پیک در کروماتوگرام نهایی نشان می‌دهد. در سرعت جریان کمتر فاز متحرک ، فاصله بین پیک ها افزایش یافته و جداسازی بهتری خواهیم داشت. معمولا گفته می شود که در ستون هایی با قطر مرسوم (کمتر از 5mm) سرعت جریان نباید بالاتر از 2/5 ml/min باشد چرا که باعث صدمه زدن به ستون و کاهش عمر مفید آن می شود.
به عنوان فاز متحرک، مخلوطی از حلال‌ها در ازای یک حلال خالص می‌تواند به‌کار گرفته شود. نسبت اجزاء فاز متحرک در طی یک تزریق ممکن است ثابت باشد که در این صورت به آن روش ایزوکراتیک (Isocratic) گفته می شود. در حالتی دیگر که به آن روش گرادیانت ) ( Gradient گفته می شود، طی یک تزریق و با پیشرفت زمان، طبق برنامه ای که از قبل برای سیستم تعریف شده است، درصد متفاوتی از دو یا چند حلال مخلوط شده و در سیستم توسط پمپ جریان می یابد. 

3- تزریق کننده(Injector): تزریق نمونه، بسته به نوع دستگاه، به دو شکل دستی و یا خودکار انجام می گیرد. در روش خودکار، نمونه در ظروف مخصوصی ریخته شده و در محل تعبیه شده در دستگاه قرار می گیرد. پس از اینکه اپراتور دستور تزریق را (از طریق نرم افزار ) می دهد، نمونه توسط یک سرنگ به سیستم منتقل می شود. در روش دستی، از سرنگ هایی با ظرفیت های مختلف برای تزریق نمونه استفاده می شود. حجم نمونه تزریق شده (در هر دو روش)، به حجم حلقه نمونه بردار ( Loop )بستگی دارد و مقدار آن معمولا در حد 5 تا 500 میکرولیتر است. نمونه ابتدا وارد این حلقه شده و پس ازآماده شدن سیستم به همراه فاز متحرک وارد ستون می شود. 

4- ستون: پس از تزریق، نمونه ابتدا وارد قسمتی به نام پیش ستون (pre-column) یا ستون محافظ (Guard column ) می شود. نقش این ستون محافظت از ستون اصلی است. طول این ستون معمولا در حد سانتی متر است و جنس آن از فولاد ضد زنگ است. ماده پرکننده (Packing) ستون محافظ از جنسی مشابه ماده پرکننده ستون اصلی است. هم جنس بودن نوع پرکننده این مزیت را دارد که اگر ماده ای که با ذرات ستون وارد واکنش شود در نمونه موجود باشد، در ابتدا در ستون محافظ به دام افتاده وستون اصلی را دچار آسیب نمی کند. طول ستونهای اصلی دستگاه معمولا حدود 30-10 سانتی متر بوده و درون ستون را با موادی که به یکی از دو فرم پوسته دار و یا متخلخل است، پر کرده اند. سایز این مواد پرکننده که بر کیفیت جداسازی تاثیر فراوانی دارد متفاوت بوده و معمولا در حد 3 تا 5 میکرومتر است.
ستون می تواند قطبی و یا غیرقطبی باشد. از مرسوم ترین ستون های غیرقطبی میتوان به C18، اکتادسیل سیلان ODS)) اشاره کرد. جنس ستونها از فولاد ضد زنگ (Stainless Steel) است. پس از ورود نمونه به ستون، بر اساس تفاوت قطبیت، اجزاء مختلف نمونه در زمان های متفاوتی با نام زمان بازداری (Retention Time) از یکدیگر جدا شده و برای تشخیص نوع ماده به سمت آشکار ساز(Detector) هدایت می شوند.
در نهایت پس از اتمام کار باید ستون را شستشو دهیم. برای شستشو، بسته به نوع ستون، حلال متفاوتی را با ترتیب خاص انتخاب می کنیم. برای مثال در ستون های غیرقطبی پس از اتمام کار، ابتدا ستون را با یک حلال قطبی (معمولا آب ) و سپس با یک حلال غیرقطبی (معمولا متانول) شستشو می دهند. 
5- آشکارساز (Detector): آشکارساز بر اساس نوع آنالیت انتخاب می شود. به طور کل یک آشکارساز خوب باید دارای ویژگی های زیر باشد:

> حساسیت بالا
> غیرتخریبی بودن (Nondestructive): در طول روند شناسایی نمونه را تخریب نکند.
> پاسخ خطی به غلظت در دامنه وسیع (برای سهولت در محاسبات)
درادامه به تعدادی ازآشکارسازهای مرسوم اشاره می شود : 

الف- از پر کاربردترین انواع آشکارساز،طیف‌سنج UV-Vis است که برای اجسامی که در این ناحیه جذب داشته باشند مورد استفاده قرار می گیرد. در این آشکارساز با استفاده از تفاوت میزان جذب نمونه با منبع نوری اولیه و در نهایت با استفاده از قانون بیر لامبرت غلظت نمونه اندازه گیری می شود. در مواردی که از این آشکارساز استفاده می شود انتخاب طول موج مناسب یکی از مواردی است که می بایست مد نظر قرار بگیرد، در طول موج انتخابی، نباید مزاحم های موجود در نمونه و همچنین حلال جذب داشته باشند.
ب- آشکارساز ضریب شکست، اساس کار این آشکارساز بر مبنای تغییراتی است که در ضریب شکست سیستم حلال به تنهایی و سیستم حلال همراه با نمونه، ایجاد می شود.پاسخ این آشکارساز به حرارت وابسته بوده و به همین دلیل معمولا به ندرت ازآن استفاده می-شود. 
ج- آشکارساز فلورسانس، حساس تر از آشکارساز UV/Vis است ولی ترکیبات کمی موجودند که خاصیت فلورسانس داشته باشند درنتیجه کاربرد این آشکارساز نیز محدود است.
د- آشکارساز الکتروشیمیایی، که عملکرد آن بر پایه واکنش های اکسید و احیا می باشد و شامل روشهای آمپرومتری (Amperometry)، پلاروگرافی(Polarography)، کلون سنجی (Coulometry) و هدایت‌سنجی (Conductometry) است.
ه- آشکارساز طیف سنج جرمی (MS): این مورد امروزه به دلیل مزایای زیادی که دارد به طور وسیعی مورد استفاده قرار می گیرد.از این جمله می‌توان به حد تشخیص (LOD) بسیار پایین، حساسیت و انتخابگری (Selectivity) بالاو امکان بررسی نمونه در حضور مزاحم‌های شیمیایی اشاره کرد.
در صورتیکه از هیچ کدام از این موارد نتوان استفاده کرد، از مشتق سازی (ایجاد تغییرات شیمیایی روی نمونه) جهت ایجاد نمونه فعال در هر یک از این آشکارسازهای ذکر شده استفاده می شود. شکل زیر نمایی از یک دستگاه HPLC را به همراه اجزاء مختلف آن به تصویر کشیده است] [.

شکل1- نمایی از دستگاهHPLC و [2]

4 اطلاعات حاصل از یک کروماتوگرام
یک نمونه کروماتوگرام در شکل 2 نشان داده شده است که در آن سه نوع قند از یکدیگر جدا شده اند. اطلاعات کمی، نیمه کمی و کیفی از ولتاموگرام قابل استخراج است.

شکل 2- نمونه‌ای از یک کروماتوگرام

4-1 کاربردهای کیفی:

آنالیز کیفی، برای تشخیص و شناسایی نوع ترکیبات انجام می شود. از آنجایی که زمان بازداری (Retention Time) برای هر ماده در یک سیستم و شرایط خاص آزمایشگاهی ثابت و مشخص می باشد، می توان از آن جهت تعیین نوع آنالیت استفاده کرد. به این منظور کروماتوگرام آنالیت را با کروماتوگرام به دست آمده از استاندارد آن آنالیت مقایسه می کنند. در صورت یکسان بودن زمان بازداری می توان با قطعیت نوع ماده را تعیین کرد. ذکر این نکته لازم است که این مقایسه این دو کروماتوگرام تنها در شرایط آزمایشگاهی و دستگاهی کاملاً یکسان معتبر است. 

4-2 آنالیز کمی:
به منظور تعیین کمی مقدار آنالیت، سطح زیر پیک و یا ارتفاع پیک ترکیب مجهول را با نمونه استاندارد مقایسه می¬کنند. در مواردی که پیک ها باریک و متقارن باشند، اندازه گیری ارتفاع پیک از صحت و سرعت بیشتری برخوردار است. هر چند که امروزه به راحتی می توان ارتفاع و سطح زیر پیک را به کمک دستگاه های الکترونیک با دقت و صحت بالایی محاسبه کرد. روشهای مختلفی جهت محاسبه مقدار مجهول وجود دارد که در ادامه به برخی از این روشها اشاره می شود:

4-2-1 روش استاندارد خارجی (External Standard): 
در این روش، محلول‌هایی با غلظت های مختلف از استاندارد (استاندارد آنالیت مورد نظر) ساخته شده و سپس بر اساس ارتفاع یا سطح زیر پیک بدست آمده از کروماتوگرام این استانداردها، منحنی کالیبراسیون ( منحنی ارتفاع و یا سطح زیر پیک، بر حسب غلظت) رسم می شود. با استفاده از معادله خط بدست آمده، مقدار ارتفاع و یا سطح زیر پیک نمونه مجهول، مقدار دقیق آنالیت محاسبه می شود.

4-2-2 روش افزایش استاندارد (Standard Addition): 
در این روش ابتدا ماده مجهول، آنالیز می شود، سپس به چند ظرف که حاوی مقدار یکسانی از نمونه است، حجم های مشخصی از استاندارد اضافه می شود و کروماتوگرام مربوط به هر مرحله را آنالیز و در نهایت ارتفاع یا سطح زیر پیک نمونه ها را بر اساس حجم استاندارد اضافه شده رسم می کنند. در نهایت با استفاده از روابط موجود می توان غلظت نمونه را محاسبه کرد. استفاده از این روش سبب حفظ بافت و ماتریس نمونه ها می شود در نتیجه با این روش احتمال مزاحمت بافت (Matrix Interference) نمونه از بین برده می شود.] [

4-2-3 استاندارد داخلی (Internal Standard): 
دو نوع خطا (سیستماتیک و تصادفی) در سیستم موجود است. برخی از این منابع ثابت را می توان با اضافه کردن یک استاندارد داخلی به نمونه ها و تقسیم ارتفاع پیک یا سطح زیر پیک مربوط به هر آنالیت بر همین مقادیر مربوط به استاندارد داخلی، حذف کرد. در انتخاب استاندارد داخلی باید به شباهت های ساختاری آنالیت با جزء انتخابی، نزدیک بودن زمان بازداری پیک آن به پیک نمونه و ..، توجه کرد. با انتخاب یک استاندارد داخلی مناسب می توان خطا را از 1 تا 2 درصد به 5.0 تا 1 درصد کاهش داد.

5- نتیجه گیری:
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، روشی مناسب جهت جداسازی، اندازه گیری، و تعیین نوع مواد است. این تکنیک با تلفیق با روشهای دیگر و آشکارسازهای پیشرفته ای مانند طیف سنج جرمی کاربرد های زیادی در علوم مختلف دارد. انتخاب فاز متحرک و ثابت، انتخاب آشکارساز و تعیین سرعت جریان فاز متحرک از جمله موارد اساسی در تنظیمات یک روش مناسب HPLC است.

منبع:

http://edu.nano.ir

HPLC آمینو اسیدها را آنالیز می کند.

HPLC ، آمینواسیدهای اولیه و ثانویه در مایعات فیزیولوژیکی مانند پلاسما و ادرار را تشخیص داده و کمی می‌کنند. این اطلاعات در تشخیص و مانیتور کردن درمان خطاهای متابولیسم مادرزادی و اختلالات دیگر استفاده می‌شوند. این اختلالات معمولا خطاهای تولیدشده به صورت ژنتیکی در متابولیسم پروتئین هستند و در صورتی که زود تشخیص داده نشده و درمان نشوند ، می‌توانند عوارض بسیار جدی ایجاد کنند. شایع‌ترین اختلال ، فنیل‌کتونور (Phenylketonuria-PKU) است که در آن کمبود آنزیم موجب افزایش غلظت فنیل آلانین می‌شود. Aminoaciduria ‌های دیگر (یعنی وجود آمینواسید بالاتر از سطح طبیعی در ادرار) شامل tyrosinemia , alkaptonuria , homocystinuria و branched-chain ketoaciduria می‌شوند. تغییر در سطح آمینواسید همچنین ممکن است در اثر فقر غذائی ، جراحت ، عفونت ، مشکل در کلیه یا کبد و سرطان ایجاد شود. 

آنالایزرهای آمینواسید می‌توانند آمینواسیدهای فعال از نظر نوروشیمیائی آسپارتات ، گلوتامات و اسید (aminobutyric) در مایع مغزی نخاعی (CSF) را تشخیص دهند و می‌توان از این اطلاعات برای دسترسی به وضعیت تغذیه بیماران قبل از جراحی و نیز پیگیری روند پیشروی درمان آن‌ها استفاده کرد.

‌اصول عملکرد

آمـیـنـواسـیـدهـا تـرکـیـبـات آلـی‌ای هـسـتـند که حـــاوی یـــک گــروه آمـیـنــو (2)NH و یــک گــروه کربوکسیل (COOH) اند که با پیوند پپتیدی برای ایجاد پروتئین‌ها به هم متصل شده‌اند. بسیاری از آن‌هـا در بـدن سـنـتـز مـی‌شـوند ؛ در حالی که بـرخـی از آن‌ها باید توسط تغذیه تأمین شوند. ویژگی مهم در جداسازی آمینواسیدها ، ساختار پایه‌ی آن‌هاست: آن‌ها به شدت قطبی‌اند و در محلول‌های آبی به صورت یون‌های دوقطبی به نام zwitterions وجود دارند که هم گروه‌های با بار مثبت و هم گروه‌های با بار منفی دارند. گروه عاملی آمینو اسید (R) که در شکل اول نشان داده شده است ، برای تفکیک آمینواسیدها از همدیگر استفاده می‌شود ؛ در شکل ، جداسازی آمینواسیدها نشان داده شده است. آمینواسیدهای اولیه یا α ، گروه آمین متصل به α یا اتم کربن متصل به گروه کربوکسیل دارند ؛ آمینواسیدهای ثانویه یا β‌‌ ، گروه آمین متصل به β یا دومین اتم کربن دارند (شکل دوم را ببینید) برخی از آنالایزرها تنها آمینواسیدهای اولیه را جدا می‌کنند ؛ در حالی که برخی از آن‌ها هم آمینواسیدهای اولیه و هم ثانویه را جدا می‌کنند.

قبل از آنالیز کروماتوگرافی ، پیوندهای پپتیدی در یک حلال حل شده و معمولا نمونه در یــک بــافــر بــا phenyl isothiocyanate) PITC) واکنـش مـی‌دهـد تـا مشتقـی از phenylthiocarbamyl) PTC) ایـجــاد شــود. آمـیـنــواسـیــدهــای PTC بــه مـشـتـقــات آمـیـنــواسـیـد phenylthiohydantoin) PTH) تبدیل می‌شوند و این ها با کروماتوگرافی از هم جداشده و با یـک معـرف مـاننـد ninhydrin واکنـش داده و یـک تـرکیـب رنگـی را تشکیـل مـی‌دهند. کـرومـاتـوگـرافـی اجـزای نمونه را بر اساس میل ترکیبی متفاوت آن‌ها با mediaهای متفاوت جدا می‌کند که به دو فاز تقسیم می‌شوند: ایستا (stationary) و متحرک (mobile). آنالیز اتوماتیک آمینواسید نیاز به HPLC دارد که از یک فاز مایع متحرک که با پمپ فشار بالا در طول یک ستون به پیش رانده می‌شود ، استفاده می‌کند. تزریق نمونه می‌تواند اتوماتیک یا دستی باشد. 

پنـج تکنیـک پـایه‌ی HPLC وجود دارند: جذب سطحی ، فاز پیوند یا پارتیشن ، فاز معکوس ، تبادل یونی و طرد اندازه (size exclusion). کروماتوگرافی جذب سطحی ، اجزا را بر اساس تفاوت در حلالیت و قدرت اتصال به جاذب سطحی از هم جدا می‌کند. در کروماتوگرافی پارتیشن-فاز ، فازهای ایستا و متحرک ، مایعات مخلوط نشدنی اند و اجزا بر اساس نسبت حل شدن آن در این دو فاز از هم جدا می‌شوند. کروماتوگرافی فاز معکوس ، مشابه با تکنیک پارتیشن است به جز این که قطبیت دو مایع معکوس است. کروماتوگرافی تبادل یونی از رزین‌های تبادل یونی برای فاز ایستا و از یک محلول بافر به عنوان فاز متحرک استفاده می‌کند. کروماتوگرافی طرد اندازه از یک ماده‌ی packing متخلخـل استفـاده مـی‌کند که مولکول‌های بزرگ‌تر را نگه داشته و به مولکول‌های کوچک‌تر اجازه ی عبور می‌دهد و به این وسیله اجزا را بر اساس اندازه‌ی مولکولی جدا می‌کند. 

اجزای پایه‌ی یک سیستم HPLC ، مخزن حلال ، پمپ فشار بالا ، تزریق کننده‌ی نمونه ، ستون تحلیلی ، دتکتور ، ثبت کننده‌ی داده و میکروپروسسور هستند. مخزن حلال ، فاز متحرک را دربرمی‌گیرد. پمپ که یک یا دو پیستون رفت و برگشتی دارد ، cam یا چرخ دنده‌هایی دارد که پیستون را به داخل و خارج از پمپ حرکت می‌دهند. در مود پرکردن ، پیستون از محفظه بیرون کشیده می‌شود و مایع از مخزن حلال به محفظه‌ی پمپ کردن کشیده می‌شود. در مود پمپ کردن ، شیر یک‌طرفه‌ی ورودی بسته شده و سوپاپ خروجی با رانده شدن مایع توسط پیستون به درون ستون باز می‌شود. یک مشکل این نوع پمپ ، طبیعت پالسی جریان حلال است ؛ البته اغلب سیستم‌ها یک مکانیزم دمپ کردن برای کنترل این اثر دارند. پمپ‌های موجود در آنالایزرهای آمینواسید معمولا از فشارهای در بازه‌ی 1000 تا 3000 پوند بر اینچ مربع (psi) استفاده می‌کنند. 

تـزریـق کننـده‌ی نمـونـه ، آن را وارد ستـون مـی‌کند. تزریق کننده‌ی حلقه-ثابت که پرکاربردتر از انواع دیگر است با استفاده از یک سرنگ غیرکالیبره پر می‌شود ؛ حجم نمونه با اندازه و قطر داخلی حلقه‌ی نمونه تعیین می‌شود. تزریق کننده‌های با حجم متغیر از یک سرنگ کالیبره شده برای تزریق حجم دقیقی از نمونه به داخل حلقه استفاده می‌کنند. 

ستون تحلیلی ، فاز ایستا را دربر می‌گیرد و مهم‌ترین بخش سیستم جداسازی است. معمولا متشکل از استیل ضدزنگ است که می‌تواند تا فشار psi 10000 را تحمل کند. طول ستون بین 10 تا 150 سانتیمتر و قطر داخلی آن از 2 تا 5 میلی متر است. ماده ی packing ستون باید حداقل حجم مرده را داشته باشد و ماکزیمم کارائی را تضمین کند (یعنی پیک‌های باریک روی کروماتوگرام) دو نوع ستون precolumn - و ستون گارد - از ستون تحلیلی محافظت می‌کنند. precolumn بین پمپ و دریچه‌ی تزریق واقع شده است و در آنالیز اسیدآمینه ، آمینواسیدهای استخراج شده را جدا می‌کند. ستون گارد که بین تزریق کننده و ستون تحلیلی قرار گرفته است ، با جمع آوری هر گونه مواد باقی مانده یا هر گونه ذرات معلـق کـه ممکـن اسـت آنجـا جمع شوند ، طول عمر ستون تحلیلی را افزایش می‌دهد. ستون‌های HPLC زمانی که با ذرات متخلخل کوچک (5µm , 3µm یا 10µm) استفاده می‌شوند ، بسیار کارا هستند. اندازه‌ی ذرات باید تا حد امکان یکنواخت باشد. ذرات کــروی و بــا شـکــل نــامنظـم در دستـرس هستند ؛ ستون‌های packed با این ذرات به نظر بـادوام تـر مـی‌رسند و در فشارهای کمتر عمل می‌کنند.

در LC تبادل یونی ، فاز ایستا یک رزین تبادل یونی است که ترکیبات را بر اساس علامت و دامـنـه‌ی بـارهـای یـونـی آنـهـا جـدا می کند. یک مـحـلــول آبــی بــه عـنـوان فـاز مـتـحـرک اسـتـفـاده مـی‌شـود. رزیـن‌هـا که پشتیبان‌های (supports) پـلـیـمــراز شــده هـسـتـنــد ، از هـیــدروکــربــن‌هــا بــا گـروه‌های عاملی یونیزه شده تشکیل شده‌اند. آن‌هـا که به صورت دانه دانه یا ذره‌ای موجود هستنـد ، counterion (یـونـی کـه بـرای حفـظ بار خـنثـای الکتـریکـی ، همـراه یـک نمـونـه‌ی یـونـی است) قابل مبادله‌ای دارند که بار مخالف گروه عاملی دارد (یعنی مبدل‌های کاتیون گروه‌های اسـیـدی و مـبـدل‌هـای کـاتـیـون گروه‌های بازی دارنـد.) کـاتـیـون نـمـونـه (X+) از رزین مبادله‌ی کــاتـیــون (اغـلــب بــرای آمـیـنــواسـیـدهـا اسـتـفـاده مـی‌شـود) بـا یـون‌های فاز متحرک (Y+) بر سر مکـان‌های یونی روی پشتیبان رقابت می کند. شکل سوم نشان می‌دهد که چگونه counterionها توسط کاتیون‌های نمونه جایگزین می‌شوند و با گروه‌های عاملی پیوند می‌دهند. مولکول‌های بی بار و آنیون‌ها در طول ستون جریان یافته و از کـاتیون‌های نمونه جدا می‌شوند. یون دیگر با میل بالاتر یا مقادیر زیادی از counterion مشابه ، می‌تواند برای شستن کاتیون‌های نمونه استفاده شــــود. در ایــــن روش هــمـچـنـیـــن ninhydrin بـــا اسیدآمینه‌های آزاد واکنش می‌دهند و می‌توان نـتـیـجه را در بازه‌ی قابل مشاهده‌ای تشخیص داد. هـمـچنین می‌توان بسته به فاز ایستا و یون نمونه ای که در ستون استفاده می‌شود ، شستشو را با کنترل کردن pH فاز متحرک تنظیم کرد.

در LC فاز معکوس ، معمولا قبل از وارد کردن نـمـونه به ستون ، یک معرف derivatizing به آن افزوده می‌شود. فاز متحرک ، قطبی و فاز ایستا غـیـرقـطـبـی اسـت ؛ بـه ایـن وسـیـلـه آمـیـنـواسیدها می‌توانند با گروه‌های عاملی خود (آمین‌ها) که در فاز عادی به شدت به سیلیس (silica) جذب مــی‌شــونــد ، جــدا شــونــد. packing غـیـرقـطـبـی ، هیدروکربن‌هایی هستند که به صورت شیمیایی بـه یـک پـایـه‌ی سیلیس متصل شده‌اند و اجازه می‌دهند که ترکیبات قطبی بیشتری در ابتدا جدا شوند. فاز متحرک قطبی می‌تواند متشکل از استونیتریل ، الکل‌های آلیفاتیکی ، آب ، تتراهیدروفورات و یا ترکیبی از این حلال‌ها باشد.

دتکتور با تکیه بر تغییر در خاصیت عمده‌ی فاز متحرک و اجزای نمونه ، مانند ضریب شکست (تغییر رنگ) یا بر اساس یک ویژگی مشخصه از اجزای نمونه مانند جذب UV یا فلورسانس ، ترکیبات را همین طور که از ستون شسته می‌شوند ، کمی می‌کند. پراستفاده‌ترین دتکتور ، فتومتر قابل رؤیت UV با طول موج ثابت یا متغیر است که می‌تواند مقادیر در حد نانوگرم را تشخیص دهد. دتکتور دیگر ، فلئورومتر ، حساسیت بالائی نسبت به ترکیبات فلئورسنت دارد و می‌تواند مقادیر در حد پیکوگرم را تعیین کند. 

مشکلات گزارش شده

زمانی که بافرها توسط میکروارگانیزم‌ها ، به ویژه گونه‌های Pseudomonas آلوده می‌شوند ، مشکلاتی ممکن است ایجاد شوند. این آلودگی می‌تواند منجر به از دست رفتن arginine شده و نیز روی بازیافت اسیدامینه های دیگر هم اثر بگذارد. نگهداری نمونه‌ها به مدت حتی 24 ساعت ، می‌تواند سطح آمینو اسید در پلاسما را تغییر دهد؛ بنـابـرایـن نمـونـه‌هـا بـاید در اسرع وقت آنالیز شوند. از آنجا که برخی از معرف‌های derivatizing ناپایدار هستند ، لذا اسیدآمینه‌های مشتق شده باید سریعاً ارزیابی شوند و تکرار کردن تست‌ها ممکن است منجر به تولید نتایج تکرارپذیر نشود. ممکن است در هنگام استفاده از دریچه‌های حلقه ثابت ، در اثر آلودگی ایجادشده از نمونه‌ی قبلی نتایج تولید شده غیرصحیح شوند. دریچه باید قبل از بارگذاری 5 تا 10 مرتبه با جریان سریع شسته شود.

روش‌هـای مختلـف استـانـداردسـازی محـدودیـت‌هـایـی دارند. با استانداردسازی خارجی ، میزان نمونه‌ی از دست رفته - هم در طول گام‌های آماده سازی و هم قبل از آنـالیـز کـرومـاتـوگـرافـی - و نیـز میـزان تـزریـق نمـونـه متغیر است. تحت شرایط نرمال ، استاندارد داخلی نباید در نمونه وجود داشته باشد: مشکل بودن اندازه گیری صحیح دو پیک می تواند دقت را محدود کند.

‌استفاده از ظروف شیشه‌ای بدون پوشش در آنالایزرهای اتوماتیک ممکن است ایمنی پرسنل آزمایشگاه را به خطر بیاندازد ؛ زیرا ریسک شکستن شیشه‌های بافر یا حلال وجود دارد. یک مورد که گزارش شده است مربوط به شکسته شدن یک شیشه بوروسیلیکات در آنالایزر آمینواسید است. آژانسی که این حادثه را گزارش کرد ، توصیه می‌کند که آزمایشگاه‌هایی که از ظروف شیشه‌ای با پوشش پلاستیک استفاده می‌کنند ، در مورد این که آیا این ظروف شیشه‌ای برای کاربرد موردنظر آن‌ها قابل استفاده است یا نه ، با تولیدکننده مشورت کنند ؛ چرا که پوشش‌های پلاستیکی متفاوت ، در برابر مواد شیمیائی مقاومت‌های مختلفی دارند و خواص آن‌ها در دماها و فشارهای مختلف ، هم متفاوت است.

منبع:

http://dastyari.parsmedic.com