کروماتوگرافی چیست

کروماتوگرافی

واژه ­ی کروماتوگرافی امروزه به دسته‌ ای از روش‌ ها اطلاق می‌ شود که در آن ­ها جداسازی بر اساس تمایل نسبی هر جزء به فاز ساکن است. گونه‌ ای که تمایل بیشتری به فاز متحرک دارد، با سرعت بیشتری حرکت ‌می‌ کند و بالعکس گونه‌ ای که به فاز ساکن تمایل بیشتری دارد، با سرعت کمتری در طول ستون حرکت می‌ کند. با روش­ های کروماتوگرافی می‌ توان جداسازی‌ هایی را که به روش‌ های دیگر خیلی مشکل می‌ باشند، انجام داد. زیرا اختلافات جزئی موجود در رفتار جزئی اجسام در جریان عبور آن­ ها از یک سیستم کروماتوگرافی چندین برابر می‌ شود‌. هر قدر این اختلاف بیشتر شود، قدرت جداسازی مواد بیشتر و برای انجام جداسازی مواد نیاز کمتری به وجود اختلافات دیگر خواهد بود. مزیت کروماتوگرافی نسبت به ستون تقطیر این است که نسبتاً آسان می‌ توان به آن دست یافت. با وجود اینکه ممکن است چندین روز طول بکشد تا یک ستون تقطیر به حداکثر بازده خود برسد، ولی یک جداسازی مواد کروماتوگرافی می‌ تواند در عرض چند دقیقه یا چند ساعت انجام گیرد. یکی از مزایای برجسته ­ی روش‌ های کروماتوگرافی این است که آن­ ها آرام هستند. به این معنی که احتمال تجزیه ­ی مواد جداشونده به وسیله این روش‌ ها در مقایسه با سایر روش‌ ها کمتر است. مزیت دیگر روش‌ های کروماتوگرافی در این است که تنها مقدار بسیار کمی از مخلوط برای تجزیه لازم است، به همین دلیل روش‌ های تجزیه‌ ای مربوط به جداسازی مواد کروماتوگرافی می‌ توانند در مقیاس میکرو و نیمه میکرو انجام گیرند. روش‌ های کروماتوگرافی ساده، سریع و وسایل مورد لزوم آن ­ها ارزان هستند. مخلوط‌ های پیچیده را می‌ت وان نسبتا به آسانی به وسیله این روش‌ ها بدست آورد. 

کروماتوگرافی گازی (GC) یکی از روش‌ های کروماتوگرافی است که برای بررسی و جداسازی مواد فرار بدون تجزیه ‏شدن آن ‏ها، به کار می‏رود. در کروماتوگرافی گازی، فاز گازی یک فاز بی اثر (هلیوم، نیتروژن، آرگون و دی­اکسیدکربن است) و به فاز متحرک گاز حامل نیز می ­گویند. فاز ساکن یک جسم جامد جاذب و یا لایه نازکی از یک مایع غیر فرار است که به دیواره ­ی داخلی ستون یا به صورت پوششی روی سطح گلوله ­های شیشه­ ای یا فلزی قرار داده شده است. در صورتی ­که فاز ساکن جسم جامد جاذب باشد، اصطلاحا کروماتوگرافی گازی گویند و اگر فاز ساکن مایع غیر فرار باشد، آن را کروماتوگرافی گاز مایع گویند. اما هر دو به کروماتوگرافی گازی معروف هستند. در کروماتوگرافی گازی، جداسازی اجزای یک مخلوط متناسب با میزان توزیع اجزای تشکیل ­دهنده ­ی مخلوط بین فاز متحرک گازی و فاز ساکن جامد یا مایع صورت می ­گیرد. در این روش گاز حامل مخلوط را درون ستون حرکت می­ دهد و در حالت تعادل اجزای تشکیل ­دهنده ­ی مخلوط بین دو فاز (گاز-مایع) توزیع می­ شوند. بنابراین، فاز متحرک اجزای تشکیل­ دهنده ­ی نمونه را به طرف بیرون ستون حرکت می­ دهد و هر مولکولی که با ارتباط سست ‏تر جذب ستون شده است، زودتر و جزیی که قدرت جذب بیشتری با ستون دارد، دیرتر از ستون خارج می ­شوند و بدین ­ترتیب اجزای مخلوط از یکدیگر جدا می ­شوند. به طور کلی، کروماتوگرافی گازی برای جداسازی و شناسایی اجزای تشکیل­ دهنده ­ی یک مخلوط و تجزیه­ ی کمی آن­ ها نیز کاربرد دارد.
انواع آشکارسازهای موجود در کروماتوگرافی گازی: یونش شعله­ای (FID): جهت شناسایی کمی و کیفی هیدروکربن­های سبک و سنگین (در حد ppm) و غلظت­های پائین CO و CO2 هدایت حرارتی (TCD): جهت شناسایی کمی و کیفی ترکیبات گازی معدنی غیرخورنده مانند O2 و N2 الکترون گیر (ECD): این دتکتور برای آنالیز ترکیبات هالوژن­دار از حساسیت بسیار بالایی برخوردار می­باشد. نیتروژن- فسفر (NPD): جهت آنالیز ترکیبات نیتروژن­دار و فسفردار کروماتوگرافی گازی با طیف­سنجی جرمی (GC-MS)  دستگاه GC-Mass مشابه دستگاه GC است، تنها تفاوت آن با GC معمولی این است که در این دستگاه دتکتور مربوطه دتکتور Mass است. کارایی این دستگاه جهت شناسایی ترکیبات آلی و آلی فلزی است که قابلیت جداسازی در کروماتوگرافی گازی را داشته باشند. این دستگاه دارای متعلقاتی همچون Head-Space بوده که جهت آنالیز ترکیبات فرار آلی از آن استفاده می­ گردد. دستگاه GC-MS از دو قسمت GC (گاز کروماتوگرافی) و MS (طیف سنجی جرمی) تشکیل شده است. در این دستگاه GC و Mass از هم جدا نمی­ باشند و وارد کردن نمونه به دستگاه Mass از طریق GC می­ باشد. در این روش، اجزای مختلف اسانس یا نمونه­ های فرار با نقطه­ی جوش پایین جداسازی می­ شود. طیف­ سنجی جرمی به عنوان آشکارساز امکان شناسایی پیک­ های کروماتوگرام گازی را میسر می­ سازد. از مقایسه ­ی الگوهای شکست پیوندها و طیف جرمی اسانس با طیف جرمی موجود در کتابخانه­ ی دستگاه، ساختار ترکیب مجهول را می­ توان تعیین نمود. کاربردهای این روش عبارتند از:  اندازه‌ گیری و شناسایی ترکیبات آلی و آلی فلزی شناسایی کیفی داروهای فرآوری مواد معدنی، داروها، مواد آلی فلزی شناسایی و اندازه‌ گیری سموم در محیط زیست
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) کروماتوگرافی مایع یکی از انواع کروماتوگرافی است که فاز متحرک در آن مایع است. کروماتوگرافی گازی نیز روش دیگری است که در آن فاز متحرک گاز است. اگر فاز متحرک گاز و فاز ساکن مایع باشد، روش را کروماتوگرافی گاز- مایع می‌نامند. روش‌های کروماتوگرافی گاز- جامد، مایع- مایع و مایع- جامد نیز وجود دارند. کروماتوگرام، نموداری از پاسخ آشکارساز بر حسب زمان، حجم فاز متحرک یا فاصله است. اطلاعات مفیدی نظیر میزان پیچیدگی نمونه، تعداد اجزای موجود در نمونه، مشخصات کیفی اجزای نمونه، درک کمی از درصد گونه‌ها موجود در نمونه و مشخصه‌های کارایی ستون، به سادگی از کروماتوگرام قابل حصول هستند. در  HPLC  اغلب از ستون‌های پر شده با ذرات ریز فاز ساکن استفاده می‌شود. به همین علت سطح بیشتری از فاز ساکن در ستون در معرض اجزاء نمونه قرار می‌گیرد و در نتیجه راندمان جداسازی در این روش بیشتر از سایر روش‌ های کروماتوگرافی است. در سیستم HPLC با استفاده از یک سوزن مخصوص وارد پیش ستون مربوطه می‌شود. هم‌ زمان از یک حلال مخصوص جهت ترکیب شدن با نمونه استفاده می‌شود. سپس نمونه با حلال مورد نظر ترکیب شده و وارد ستون مربوطه می شود و بر اساس میزان قطبیت حلال و ترکیب از یکدیگر جدا می‌شوند. همچنین نمونه بر اساس زمان بازداری از یکدیگر تفکیک می‌شوند.

 در دستگاه HPLC سیستم پیچیده تری نسبت به دیگر روش­های کروماتوگرافی وجود دارد. اغلب از ستون‌های پر شده با ذرات ریز فاز ساکن استفاده می‌شود. به همین علت سطح بیشتری از فاز ساکن در ستون، در معرض اجزاء نمونه قرار می‌گیرد و در نتیجه راندمان جداسازی در این روش بالا است. این روش برخلاف روش GC و GC-MS برای نمونه های غیر فرار کاربرد دارد.

 

کاربردهای کروماتوگرافی مایع عبارتند از: 

• امکان شناسایی همزمان چندین عنصر
• امکان شناسایی و سنجش بیش از 70 عنصر در مقیاس ppt به صورت کیفی و نیمه کمی
• حذف کامل گونه­های تداخلی چند اتمی با استفاده از تکنولوژی DRC
• قابلیت آنالیز ایزوتوپی عناصر
• آنالیز نمونه های خاک، آب، مواد شیمیایی، نمونه های بیولوژیکی و باستانی، فلزات، نیمه رساناها و ... در مقادیر بسیار اندک
• آنالیز نمونه های مجهول به روش آنالیز نیمه کمی 

 

انواع آشکارسازها: 

• آشکارساز فرابنفش- مرئی: یکی از پرکاربردترین انواع آشکارسازها بوده که برای اجسامی که در ناحیه­ی فرابنفش- مرئی جذب داشته باشند، مورد استفاده قرار می­گیرد. در این آشکارساز با استفاده از تفاوت میزان جذب نمونه با منبع نوری اولیه و در نهایت با استفاده از قانون بیر لامبرت غلظت نمونه اندازه­گیری می­شود. در مواردی که از این آشکارساز استفاده می­شود، انتخاب طول موج مناسب یکی از مواردی است که می­بایست مد نظر قرار بگیرد. در طول موج انتخابی، نباید مزاحم­های موجود در نمونه و همچنین حلال جذب داشته باشند.
• آشکارساز ضریب شکست: اساس کار این آشکارساز بر مبنای تغییراتی است که در ضریب شکست سیستم حلال به تنهایی و سیستم حلال همراه با نمونه، ایجاد می­شود. پاسخ این آشکارساز به حرارت وابسته بوده و به همین دلیل معمولاً به ندرت از آن استفاده می­شود.
• آشکارساز فلورسانس: این آشکارساز از آشکارساز فرابنفش- مرئی حساس­تر است، ولی ترکیبات کمی موجودند که خاصیت فلورسانس داشته باشند. بنابراین کاربرد این آشکارساز نیز محدود است.
• آشکارساز الکتروشیمیایی: عملکرد این نوع آشکارساز بر پایه­ی واکنش­های اکسیداسیون و احیا می­باشد و شامل روش­های آمپرومتری، پلاروگرافی، کلون­سنجی و هدایت‌سنجی  می­باشد.
• آشکارساز طیف­سنج جرمی: امروزه، این آشکارساز به دلیل مزایای متعددی که دارد، به طور وسیعی مورد استفاده قرار می گیرد. از جمله مزایای آن می توان به حد تشخیص بسیار پایین، حساسیت و گزینش پذیری بالا و امکان بررسی نمونه در حضور مزاحم های شیمیایی اشاره کرد. 

 

انتخاب بهترین روش کروماتوگرافی

انتخاب نوع روش کروماتوگرافی به جز در موارد واضح (مانند کروماتوگرافی گازی در جداسازی مواد گازها) عموما تجربی است. زیرا هنوز هیچ راهی جهت پیش­بینی بهترین روش برای جداسازی مواد، مگر در چند مورد ساده وجود ندارد. در ابتدا روش‌های ساده‌تر مانند کروماتوگرافی کاغذی و لایه نازک امتحان می‌شوند. زیرا این روش‌ها در صورتی که مستقیما قادر به جداسازی مواد نباشند، نوع سیستم کروماتوگرافی را که جداسازی مواد به وسیله آن باید صورت بگیرد، مشخص می‌کنند. آنگاه در صورت لزوم از روش‌های پیچیده‌تر استفاده می‌شود. در جداسازی‌ های مشکل زمانی­که که روش‌ های ساده فاقد کارایی لازم هستند، روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) می تواند جوابگو باشد.

 

تفاوت HPLC با GC

 1- چون اغلب مواد آلی ناپایدار و کم فرار هستند، برای کار با GC باید آن­ها را به مشتقات فرار تبدیل کرد که ایجاد مشتقات فرار و باقی ماندن جزیی از مشتق­ساز ایجاد پیک­هایی می­کند که نتایج آزمایش را مختل می­سازد، حال آنکه جداسازی این گونه مواد با HPLC به آسانی امکان­پذیر است.

2- دو فاز ثابت و متحرک در HPLC به طور رقابتی عمل می­کنند و جداسازی به وسیله­ی دو فاز انجام می­شود، در صورتی که در GC یک فاز یعنی فاز ثابت عمل جداسازی را انجام می­دهد.

3- یکی از مزایای HPLC وجود شناساگردهای آن است که برای هر دسته از ترکیبات شناساگرهای انتخابی ویژه وجود دارد که این تنوع شناساگرها از مزایای HPLC است. در صورتی­که در GC شناساگرها محدودتر می­باشد.

4- مدت آنالیز در HPLC فوق­العاده اندک است، آنالیز ترکیبات آلی ناپایدار و کم فرار مواد خوراکی، شیمیایی دارویی توسط HPLC امکان­پذیر است.

5- مواد بسیار قطبی را با GC نمی­توان آنالیز کرد در صورتی­که با HPLC می­شود.

6- در HPLC به سبب دو فاز رقابتی پیک ها معمولا به صورت متقارن هستند، در صورتی­که در GC اغلب پیک­ها به صورت نامتقارن هستند و محاسبه­ی مساحت زیر منحنی یا AUC با اشکال و خطا است. ولی در HPLC به سبب وجود تقارن محاسبه AUC دقیق انجام می­شود.

7- وجود آب در نمونه­های آزمایش در HPLC اشکال ایجاد نمی­کند، در صورتی­که در GC وجود اندک آب سبب تخریب آشکارساز می­شود.

8- وجود آب در شبکه­ی کریستالی، وجود مولکول­های هیدروژن آب در HPLC قابل تشخیص، ولی در GC قابل ارزیابی نیست.

9- وجود ناخالصی­ها به ویژه ناخالصی­های بسیار قطبی و یا با وزن مولکولی بالا در HPLC قابل تشخیص، ولی در GC قابل تشخیص نیست.

منبع:

http://daypetronic.com