HPLC آمینو اسیدها را آنالیز می کند.

HPLC ، آمینواسیدهای اولیه و ثانویه در مایعات فیزیولوژیکی مانند پلاسما و ادرار را تشخیص داده و کمی می‌کنند. این اطلاعات در تشخیص و مانیتور کردن درمان خطاهای متابولیسم مادرزادی و اختلالات دیگر استفاده می‌شوند. این اختلالات معمولا خطاهای تولیدشده به صورت ژنتیکی در متابولیسم پروتئین هستند و در صورتی که زود تشخیص داده نشده و درمان نشوند ، می‌توانند عوارض بسیار جدی ایجاد کنند. شایع‌ترین اختلال ، فنیل‌کتونور (Phenylketonuria-PKU) است که در آن کمبود آنزیم موجب افزایش غلظت فنیل آلانین می‌شود. Aminoaciduria ‌های دیگر (یعنی وجود آمینواسید بالاتر از سطح طبیعی در ادرار) شامل tyrosinemia , alkaptonuria , homocystinuria و branched-chain ketoaciduria می‌شوند. تغییر در سطح آمینواسید همچنین ممکن است در اثر فقر غذائی ، جراحت ، عفونت ، مشکل در کلیه یا کبد و سرطان ایجاد شود. 

آنالایزرهای آمینواسید می‌توانند آمینواسیدهای فعال از نظر نوروشیمیائی آسپارتات ، گلوتامات و اسید (aminobutyric) در مایع مغزی نخاعی (CSF) را تشخیص دهند و می‌توان از این اطلاعات برای دسترسی به وضعیت تغذیه بیماران قبل از جراحی و نیز پیگیری روند پیشروی درمان آن‌ها استفاده کرد.

‌اصول عملکرد

آمـیـنـواسـیـدهـا تـرکـیـبـات آلـی‌ای هـسـتـند که حـــاوی یـــک گــروه آمـیـنــو (2)NH و یــک گــروه کربوکسیل (COOH) اند که با پیوند پپتیدی برای ایجاد پروتئین‌ها به هم متصل شده‌اند. بسیاری از آن‌هـا در بـدن سـنـتـز مـی‌شـوند ؛ در حالی که بـرخـی از آن‌ها باید توسط تغذیه تأمین شوند. ویژگی مهم در جداسازی آمینواسیدها ، ساختار پایه‌ی آن‌هاست: آن‌ها به شدت قطبی‌اند و در محلول‌های آبی به صورت یون‌های دوقطبی به نام zwitterions وجود دارند که هم گروه‌های با بار مثبت و هم گروه‌های با بار منفی دارند. گروه عاملی آمینو اسید (R) که در شکل اول نشان داده شده است ، برای تفکیک آمینواسیدها از همدیگر استفاده می‌شود ؛ در شکل ، جداسازی آمینواسیدها نشان داده شده است. آمینواسیدهای اولیه یا α ، گروه آمین متصل به α یا اتم کربن متصل به گروه کربوکسیل دارند ؛ آمینواسیدهای ثانویه یا β‌‌ ، گروه آمین متصل به β یا دومین اتم کربن دارند (شکل دوم را ببینید) برخی از آنالایزرها تنها آمینواسیدهای اولیه را جدا می‌کنند ؛ در حالی که برخی از آن‌ها هم آمینواسیدهای اولیه و هم ثانویه را جدا می‌کنند.

قبل از آنالیز کروماتوگرافی ، پیوندهای پپتیدی در یک حلال حل شده و معمولا نمونه در یــک بــافــر بــا phenyl isothiocyanate) PITC) واکنـش مـی‌دهـد تـا مشتقـی از phenylthiocarbamyl) PTC) ایـجــاد شــود. آمـیـنــواسـیــدهــای PTC بــه مـشـتـقــات آمـیـنــواسـیـد phenylthiohydantoin) PTH) تبدیل می‌شوند و این ها با کروماتوگرافی از هم جداشده و با یـک معـرف مـاننـد ninhydrin واکنـش داده و یـک تـرکیـب رنگـی را تشکیـل مـی‌دهند. کـرومـاتـوگـرافـی اجـزای نمونه را بر اساس میل ترکیبی متفاوت آن‌ها با mediaهای متفاوت جدا می‌کند که به دو فاز تقسیم می‌شوند: ایستا (stationary) و متحرک (mobile). آنالیز اتوماتیک آمینواسید نیاز به HPLC دارد که از یک فاز مایع متحرک که با پمپ فشار بالا در طول یک ستون به پیش رانده می‌شود ، استفاده می‌کند. تزریق نمونه می‌تواند اتوماتیک یا دستی باشد. 

پنـج تکنیـک پـایه‌ی HPLC وجود دارند: جذب سطحی ، فاز پیوند یا پارتیشن ، فاز معکوس ، تبادل یونی و طرد اندازه (size exclusion). کروماتوگرافی جذب سطحی ، اجزا را بر اساس تفاوت در حلالیت و قدرت اتصال به جاذب سطحی از هم جدا می‌کند. در کروماتوگرافی پارتیشن-فاز ، فازهای ایستا و متحرک ، مایعات مخلوط نشدنی اند و اجزا بر اساس نسبت حل شدن آن در این دو فاز از هم جدا می‌شوند. کروماتوگرافی فاز معکوس ، مشابه با تکنیک پارتیشن است به جز این که قطبیت دو مایع معکوس است. کروماتوگرافی تبادل یونی از رزین‌های تبادل یونی برای فاز ایستا و از یک محلول بافر به عنوان فاز متحرک استفاده می‌کند. کروماتوگرافی طرد اندازه از یک ماده‌ی packing متخلخـل استفـاده مـی‌کند که مولکول‌های بزرگ‌تر را نگه داشته و به مولکول‌های کوچک‌تر اجازه ی عبور می‌دهد و به این وسیله اجزا را بر اساس اندازه‌ی مولکولی جدا می‌کند. 

اجزای پایه‌ی یک سیستم HPLC ، مخزن حلال ، پمپ فشار بالا ، تزریق کننده‌ی نمونه ، ستون تحلیلی ، دتکتور ، ثبت کننده‌ی داده و میکروپروسسور هستند. مخزن حلال ، فاز متحرک را دربرمی‌گیرد. پمپ که یک یا دو پیستون رفت و برگشتی دارد ، cam یا چرخ دنده‌هایی دارد که پیستون را به داخل و خارج از پمپ حرکت می‌دهند. در مود پرکردن ، پیستون از محفظه بیرون کشیده می‌شود و مایع از مخزن حلال به محفظه‌ی پمپ کردن کشیده می‌شود. در مود پمپ کردن ، شیر یک‌طرفه‌ی ورودی بسته شده و سوپاپ خروجی با رانده شدن مایع توسط پیستون به درون ستون باز می‌شود. یک مشکل این نوع پمپ ، طبیعت پالسی جریان حلال است ؛ البته اغلب سیستم‌ها یک مکانیزم دمپ کردن برای کنترل این اثر دارند. پمپ‌های موجود در آنالایزرهای آمینواسید معمولا از فشارهای در بازه‌ی 1000 تا 3000 پوند بر اینچ مربع (psi) استفاده می‌کنند. 

تـزریـق کننـده‌ی نمـونـه ، آن را وارد ستـون مـی‌کند. تزریق کننده‌ی حلقه-ثابت که پرکاربردتر از انواع دیگر است با استفاده از یک سرنگ غیرکالیبره پر می‌شود ؛ حجم نمونه با اندازه و قطر داخلی حلقه‌ی نمونه تعیین می‌شود. تزریق کننده‌های با حجم متغیر از یک سرنگ کالیبره شده برای تزریق حجم دقیقی از نمونه به داخل حلقه استفاده می‌کنند. 

ستون تحلیلی ، فاز ایستا را دربر می‌گیرد و مهم‌ترین بخش سیستم جداسازی است. معمولا متشکل از استیل ضدزنگ است که می‌تواند تا فشار psi 10000 را تحمل کند. طول ستون بین 10 تا 150 سانتیمتر و قطر داخلی آن از 2 تا 5 میلی متر است. ماده ی packing ستون باید حداقل حجم مرده را داشته باشد و ماکزیمم کارائی را تضمین کند (یعنی پیک‌های باریک روی کروماتوگرام) دو نوع ستون precolumn - و ستون گارد - از ستون تحلیلی محافظت می‌کنند. precolumn بین پمپ و دریچه‌ی تزریق واقع شده است و در آنالیز اسیدآمینه ، آمینواسیدهای استخراج شده را جدا می‌کند. ستون گارد که بین تزریق کننده و ستون تحلیلی قرار گرفته است ، با جمع آوری هر گونه مواد باقی مانده یا هر گونه ذرات معلـق کـه ممکـن اسـت آنجـا جمع شوند ، طول عمر ستون تحلیلی را افزایش می‌دهد. ستون‌های HPLC زمانی که با ذرات متخلخل کوچک (5µm , 3µm یا 10µm) استفاده می‌شوند ، بسیار کارا هستند. اندازه‌ی ذرات باید تا حد امکان یکنواخت باشد. ذرات کــروی و بــا شـکــل نــامنظـم در دستـرس هستند ؛ ستون‌های packed با این ذرات به نظر بـادوام تـر مـی‌رسند و در فشارهای کمتر عمل می‌کنند.

در LC تبادل یونی ، فاز ایستا یک رزین تبادل یونی است که ترکیبات را بر اساس علامت و دامـنـه‌ی بـارهـای یـونـی آنـهـا جـدا می کند. یک مـحـلــول آبــی بــه عـنـوان فـاز مـتـحـرک اسـتـفـاده مـی‌شـود. رزیـن‌هـا که پشتیبان‌های (supports) پـلـیـمــراز شــده هـسـتـنــد ، از هـیــدروکــربــن‌هــا بــا گـروه‌های عاملی یونیزه شده تشکیل شده‌اند. آن‌هـا که به صورت دانه دانه یا ذره‌ای موجود هستنـد ، counterion (یـونـی کـه بـرای حفـظ بار خـنثـای الکتـریکـی ، همـراه یـک نمـونـه‌ی یـونـی است) قابل مبادله‌ای دارند که بار مخالف گروه عاملی دارد (یعنی مبدل‌های کاتیون گروه‌های اسـیـدی و مـبـدل‌هـای کـاتـیـون گروه‌های بازی دارنـد.) کـاتـیـون نـمـونـه (X+) از رزین مبادله‌ی کــاتـیــون (اغـلــب بــرای آمـیـنــواسـیـدهـا اسـتـفـاده مـی‌شـود) بـا یـون‌های فاز متحرک (Y+) بر سر مکـان‌های یونی روی پشتیبان رقابت می کند. شکل سوم نشان می‌دهد که چگونه counterionها توسط کاتیون‌های نمونه جایگزین می‌شوند و با گروه‌های عاملی پیوند می‌دهند. مولکول‌های بی بار و آنیون‌ها در طول ستون جریان یافته و از کـاتیون‌های نمونه جدا می‌شوند. یون دیگر با میل بالاتر یا مقادیر زیادی از counterion مشابه ، می‌تواند برای شستن کاتیون‌های نمونه استفاده شــــود. در ایــــن روش هــمـچـنـیـــن ninhydrin بـــا اسیدآمینه‌های آزاد واکنش می‌دهند و می‌توان نـتـیـجه را در بازه‌ی قابل مشاهده‌ای تشخیص داد. هـمـچنین می‌توان بسته به فاز ایستا و یون نمونه ای که در ستون استفاده می‌شود ، شستشو را با کنترل کردن pH فاز متحرک تنظیم کرد.

در LC فاز معکوس ، معمولا قبل از وارد کردن نـمـونه به ستون ، یک معرف derivatizing به آن افزوده می‌شود. فاز متحرک ، قطبی و فاز ایستا غـیـرقـطـبـی اسـت ؛ بـه ایـن وسـیـلـه آمـیـنـواسیدها می‌توانند با گروه‌های عاملی خود (آمین‌ها) که در فاز عادی به شدت به سیلیس (silica) جذب مــی‌شــونــد ، جــدا شــونــد. packing غـیـرقـطـبـی ، هیدروکربن‌هایی هستند که به صورت شیمیایی بـه یـک پـایـه‌ی سیلیس متصل شده‌اند و اجازه می‌دهند که ترکیبات قطبی بیشتری در ابتدا جدا شوند. فاز متحرک قطبی می‌تواند متشکل از استونیتریل ، الکل‌های آلیفاتیکی ، آب ، تتراهیدروفورات و یا ترکیبی از این حلال‌ها باشد.

دتکتور با تکیه بر تغییر در خاصیت عمده‌ی فاز متحرک و اجزای نمونه ، مانند ضریب شکست (تغییر رنگ) یا بر اساس یک ویژگی مشخصه از اجزای نمونه مانند جذب UV یا فلورسانس ، ترکیبات را همین طور که از ستون شسته می‌شوند ، کمی می‌کند. پراستفاده‌ترین دتکتور ، فتومتر قابل رؤیت UV با طول موج ثابت یا متغیر است که می‌تواند مقادیر در حد نانوگرم را تشخیص دهد. دتکتور دیگر ، فلئورومتر ، حساسیت بالائی نسبت به ترکیبات فلئورسنت دارد و می‌تواند مقادیر در حد پیکوگرم را تعیین کند. 

مشکلات گزارش شده

زمانی که بافرها توسط میکروارگانیزم‌ها ، به ویژه گونه‌های Pseudomonas آلوده می‌شوند ، مشکلاتی ممکن است ایجاد شوند. این آلودگی می‌تواند منجر به از دست رفتن arginine شده و نیز روی بازیافت اسیدامینه های دیگر هم اثر بگذارد. نگهداری نمونه‌ها به مدت حتی 24 ساعت ، می‌تواند سطح آمینو اسید در پلاسما را تغییر دهد؛ بنـابـرایـن نمـونـه‌هـا بـاید در اسرع وقت آنالیز شوند. از آنجا که برخی از معرف‌های derivatizing ناپایدار هستند ، لذا اسیدآمینه‌های مشتق شده باید سریعاً ارزیابی شوند و تکرار کردن تست‌ها ممکن است منجر به تولید نتایج تکرارپذیر نشود. ممکن است در هنگام استفاده از دریچه‌های حلقه ثابت ، در اثر آلودگی ایجادشده از نمونه‌ی قبلی نتایج تولید شده غیرصحیح شوند. دریچه باید قبل از بارگذاری 5 تا 10 مرتبه با جریان سریع شسته شود.

روش‌هـای مختلـف استـانـداردسـازی محـدودیـت‌هـایـی دارند. با استانداردسازی خارجی ، میزان نمونه‌ی از دست رفته - هم در طول گام‌های آماده سازی و هم قبل از آنـالیـز کـرومـاتـوگـرافـی - و نیـز میـزان تـزریـق نمـونـه متغیر است. تحت شرایط نرمال ، استاندارد داخلی نباید در نمونه وجود داشته باشد: مشکل بودن اندازه گیری صحیح دو پیک می تواند دقت را محدود کند.

‌استفاده از ظروف شیشه‌ای بدون پوشش در آنالایزرهای اتوماتیک ممکن است ایمنی پرسنل آزمایشگاه را به خطر بیاندازد ؛ زیرا ریسک شکستن شیشه‌های بافر یا حلال وجود دارد. یک مورد که گزارش شده است مربوط به شکسته شدن یک شیشه بوروسیلیکات در آنالایزر آمینواسید است. آژانسی که این حادثه را گزارش کرد ، توصیه می‌کند که آزمایشگاه‌هایی که از ظروف شیشه‌ای با پوشش پلاستیک استفاده می‌کنند ، در مورد این که آیا این ظروف شیشه‌ای برای کاربرد موردنظر آن‌ها قابل استفاده است یا نه ، با تولیدکننده مشورت کنند ؛ چرا که پوشش‌های پلاستیکی متفاوت ، در برابر مواد شیمیائی مقاومت‌های مختلفی دارند و خواص آن‌ها در دماها و فشارهای مختلف ، هم متفاوت است.

منبع:

http://dastyari.parsmedic.com