کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا HPLC

در کروماتوگرافی مایع-مایع معمولی از ستون های پرشده با قطر ذرات 50 تا 200 میکرومتر استفاده می شود بنابراین افت فشار زیادی در حین عبور فاز متحرک (حلال) از درون ستون بوجود می آید در HPLC این قطر ذرات به 3 تا 10 میکرومتر می رسد که فوق العاده افت فشار ایجاد می کند برای رفع این مشکل از پمپ با فشار بالا استفاده می شود چون هر چه قطر ذرات فاز ساکن کاهش یابد کارایی افزایش می یابد به همین دلیل گفته می شود کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

انواع HPLC

<!--[if !supportLists]-->1-   <!--[endif]-->تقسیمی Partition

<!--[if !supportLists]-->2-   <!--[endif]-->جذب سطحی adsorption

<!--[if !supportLists]-->3-   <!--[endif]-->تبادل یونی Ion-Exchange

<!--[if !supportLists]-->4-   <!--[endif]-->اندازه طردی Size-Exclusion

شکل زیر نحوه استفاده از HPLC را بر حسب اندازه مولکول ها و قطبیت آنها نشان میدهد.

 

پهن شدگی نوار اضافه – ستون

Extra-column Band Broadening

یک نوع پهن شدگی علاوه بر پهن شدگی معادله وان دیمتر در HPLC بوجود می آید که در اثر تفاوت سرعت حرکت مایع در وسط لوله و جداره ها بوجود می آید همواره جبهه ای از مایع در وسط جلوتر از بقیه مایع حرکت می کند بنابراین آنالیت موجود در جبهه ی اول مایع زودتر به دتکتور می رسد و پهن شدگی اتفاق می افتد.

دستگاهوری HPLC

<!--[if !supportLists]-->1-   <!--[endif]-->سیستم حلال

<!--[if !supportLists]-->2-   <!--[endif]-->سیستم تزریق نمونه

<!--[if !supportLists]-->3-   <!--[endif]-->ستون

<!--[if !supportLists]-->4-   <!--[endif]-->آشکارساز

<!--[if !supportLists]-->5-   <!--[endif]-->سیستم پردازش داده ها

سیستم حلال

در HPLC فاز متحرک با آنالیت بر همکنش دارد و با تغییر آن ضریب ظرفیت و  گزینش پذیری را می توان به صورت دلخواه در آورد

انواع سیستم حلال

<!--[if !supportLists]-->1-                                                                                       <!--[endif]-->Isocrating elution

در ایزوکراتیک ترکیب حلال ها در طول شویش ثابت است و فقط یک پمپ کار می کند

<!--[if !supportLists]-->2-                                                                                       <!--[endif]-->Gradient elution

در شویش گرادیانت (شویش شیبی) بیش از یک حلال استفاده شده و ترکیب حلال ها مطابق برنامه شویش در طول زمان آنالیز تغییر میکند

سیستم گاززدا

وجود اکسیژن یا نیتروژن در فاز متحرک باعث پهن شدگی می شود زیرا تولید حباب می کنند برای گاززدایی از حمام اولتراسونیک یا گاز هلیم استفاده می شود

پمپ

باید در حدود 350 بار فشار ایجاد کند و دارای انواع زیر هستند

<!--[if !supportLists]-->1-   <!--[endif]-->پیستونی

<!--[if !supportLists]-->2-   <!--[endif]--> جابجایی یا سرنگی

<!--[if !supportLists]-->3-   <!--[endif]-->بادی

پمپ های پیستونی متدوالترند و مانند پمپهای سرنگی مستقل از گرانروی حلال و افت فشار در ستون هستند اما پمپهای بادی ساده و ارزان هستند و این عیب را دارند که به ویسکوزیته حلال وابسته بوده و دارای افت فشار در ستون می شوند بنابراین در شویش گرادیانی نمی توان از پمپ بادی استفاده کرد

محفظه تزریق

به دلیل فشار بالا در ابتدای ستون و جلوگیری از افت فشار از لوپ (loop) برای تزریق همراه با شیرهای چند راهه استفاده می شود در سیستم حلقه – نمونه (sample loop) نیم تا 220 میکرولیتر از نمونه به طور تکرار پذیر با چرخاندن شیر تزریق وارد ستون می شود این سیستم باعث توقف عبور حلال نمی شود

این شیرها دارای دو حالت بارگذاری یا loading و تزریق یا injection می باشند.

ستون های HPLC

از ستونهای packed با طول های 3 تا 25 سانتی متر و قطر درونی 3 تا 5 میلی متر با تحمل فشار 35 تا 215 بار استفاده می شود

اخیرا ستونهای میکروبور با طول 25 تا 50 سانتی متر و قطر 1 تا 2 میلیمتر و گستره فشار 70 تا 350 بار و مصرف حلال کمتر از نسل جدید ستون های HPLC محسوب می شوند

ستون محافظ Gard Column چیست

ستونهای با طول بسیار کوتاهتر و پر شده از سیلیکاژل هستند که در ابتدای ستون و بعد از محفظه تزریق قرار می گیرند و برای حذف آلودگی های نمونه و حلال و افزایش طول عمر ستون بکار می روند

فاز ساکن

در کروماتوگرافی تقسیمی دو فاز ساکن کاربرد زیادی دارد

<!--[if !supportLists]-->1-   <!--[endif]-->فاز مایع پیوند شیمیایی شده بر تکیه گاه

<!--[if !supportLists]-->2-   <!--[endif]-->فاز ساکن مایع جذب سطحی شده بر تکیه گاه

در اولی ترکیبات سلیکا به طور شیمیایی با سطح تکیه گاه پیوند داده شده اند. در اثر واکنش شیمیایی بین گروه های سیلانول Si-OH و گروههای  کلرو سیلان می توان گروههای عاملی را روی سطح سلیکا نشاند

ایجاد فاز ساکن پیوندی باعث ایجاد گستره وسیعی از قطبیت برای فاز ساکن و نیز افزایش سطح تماس می شود

پرسش

از کروماتوگرافی گازی برای جداسازی گونه های ...................... و از کروماتوگرافی مایع جهت جداسازی گونه های ................... استفاده می شود

1) خنثی – یونی                                2) خنثی – یونی و خنثی

3) یونی و خنثی – یونی و خنثی             4) یونی – خنثی

کروماتوگرافی تقسیمی فاز نرمال و معکوس

بر اساس قطبیت فاز ساکن و متحرک دو نوع HPLC وجود دارد

<!--[if !supportLists]-->1-   <!--[endif]-->فاز نرمال (NP): فاز ساکن قطبی  مانند فاز غیر پیوندی دارای سیلان و فاز متحرک غیر قطبی مانند هگزان است در این حالت گونه های قطبی تر دیرتر خارج می شوند

<!--[if !supportLists]-->2-   <!--[endif]-->فاز معکوس یا RP: ترکیب فاز ساکن ناقطبی و فاز متحرک قطبی است. گونه های قطبی تر زودتر خارج می شوند.

ترتیب شویش حلال در RP

<!--[if !vml]--><!--[endif]-->

آشکارسازهای HPLC

<!--[if !supportLists]-->1-   <!--[endif]-->اختصاصی: به خاصیتی از آنالیت پاسخ می دهد

UV: اگر آنالیت دارای جذب uv باشد مانند قندها و داروها از این دتکتور استفاده می شود

فلوئورسانس: آنالیت باید قابلیت فلوئورسانس داشته باشد

مزیت این دتکتورها در این است که برای اجزاء دیگر نمونه پاسخی دریافت نمی شود

<!--[if !supportLists]-->2-   <!--[endif]-->عمومی:

به خاصیت کلی از فاز متحرک پاسخ می دهد

    ضریب شکست (RID) : تفاوت در ضریب شکست حلال خالص و فاز متحرک محتوی نمونه برای اندازه گیری غلظت آنالیت ها استفاده می شود

    دتکتورهای الکتروشیمیایی:

تغییر پارامترهایی مانند آمپرومتری، پلاروگرافی، هدایت سنجی در حالت حلال خالص و نیز فاز متحرک محتوی نمونه باعث سنجش مقدار آنالیت ها می شود.